Applikationsnote AN-1-102: Sukkerindhold via °Brix-indeks og refraktometri med SpectroCuvette™ One og UV-Vis-spektrofotometer

Opdateret: 2023-08-11, forfatter(e): CMLBY, EMIHO, ARPDE

Udfordring
Refraktometre er et nyttigt værktøj til at måle sukkerindholdet i en opløsning via °Brix-indekset. Nøjagtigheden kan dog påvirkes af luftbobler, partikler eller andre urenheder i prøven. Refraktometre har typisk også et begrænset område, som måske ikke egner sig til høje sukkerkoncentrationer eller prøver med andre opløste stoffer. Hyppig kalibrering er desuden ofte påkrævet, hvilket kan være tidskrævende. Hvordan kan du bruge andet udstyr?

Løsning
SpectroCuvette™ One bruger eksisterende spektrofotometre og softwaren SpectroWorks™ til nøjagtigt at måle brydningsindeks, °Brix-indeks og sukrosekoncentrationer. Resultaterne påvirkes ikke af urenheder, har et bredt brydningsindeksområde og kræver ikke kalibrering for præcise målinger. 

1 Indledning

Sukker er en populær ingrediens i mange føde- og drikkevarer. Betegnelsen “sukker” dækker søde, vandopløselige kulhydrater, herunder monosakkarider som glukose og fruktose. Sukrose er det kemiske navn for disakkaridet, der består af én glukose- og én fruktoseenhed. Forskellige typer sukker kan udvindes fra de fleste planters væv og anvendes kommercielt.

Figur 1: Forbrugskuvetten SpectroCuvette™ One, som kræves for at udføre målinger i et spektrofotometer sammen med analyse i softwaren SpectroWorks™.

Måling af brydningsindeks er en veletableret metode til at bestemme sukkerindholdet i opløsninger. Derfor er refraktometri en udbredt metode i sukkerindustrien til hurtigt at måle sukkerindholdet i opløsninger. For opløsninger, der indeholder én kendt forbindelse, er måling af brydningsindekset en præcis måde at bestemme koncentrationen af netop det sukker. I blandede opløsninger med højt sukkerindhold kan målingen af brydningsindekset derimod kun give et omtrentligt skøn over sukkerindholdet på grund af interfererende faktorer som andre opløste stoffer eller urenheder. Alligevel forbliver brydningsindekset et værdifuldt værktøj til at analysere sukkerindhold i mange anvendelser.

Figur 2: Eksempler på UV-Vis-spektrofotometre. SpectroCuvette™ One skal indsættes i et spektrofotometer for at få spektret fra A- og B-siden.

Traditionelt har refraktometre været det værktøj, der bruges til at måle sukkerindholdet i en opløsning via °Brix-indekset. Nøjagtigheden kan dog påvirkes af luftbobler, partikler eller andre urenheder i prøven. Refraktometre har typisk også et begrænset måleområde, som måske ikke egner sig til høje sukkerkoncentrationer eller prøver med andre opløste stoffer. Endelig er hyppig kalibrering ofte påkrævet, hvilket både kan være besværligt og tidskrævende. På grund af disse praktiske begrænsninger er der udviklet forskellige alternativer, herunder SpectroCuvette™ One til brug i et kuvettebaseret UV-Vis-spektrofotometer.

Figur 3: Data fra SpectroCuvette™ One analyseres med cloudsoftwaren SpectroWorks™ på https://spectroworks.com/.

Som alternativ er SpectroCuvette™ One en ny teknik, der giver dig en brugervenlig procedure
til måling af brydningsindeks. SpectroCuvette™ One udnytter eksisterende spektrofotometre og softwaren SpectroWorks™ til nøjagtigt at måle brydningsindeks, °Brix-indeks og sukrosekoncentrationer.

Med SpectroCuvette™ One er fordelene, at resultaterne ikke påvirkes af urenheder, har et bredt brydningsindeksområde og ikke kræver kalibrering for præcise målinger.

SpectroCuvette™ One skaber øjeblikkelig værdi i ethvert laboratorium og på enhver kvalitetskontrolstation. Den bygger på det spektrofotometerudstyr, der allerede findes i laboratorierne. Derfor kan målingen udføres uden forudgående investering, kalibrering eller oplæring, da du ikke har brug for et refraktometer.

2 Metode og instrumentering

I stedet for at opfinde et nyt optisk apparat er vores teknologi SpectroCuvette™ One en ny kuvette, der indeholder prøver til udbredte spektrofotometriske eksperimenter, med avanceret optisk analyse i den online cloudsoftware SpectroWorks™, se figur 3. Vores kerneteknologi introducerer et nyskabende design, der giver spektrofotometerbrugere mulighed for at måle både absorbans og brydningsindeks, se figur 1.

Vores kuvetter har en overflade med en fotonisk krystal, som for første gang gør det muligt at måle brydningsindeks i et spektrofotometer, se figur 5, sammen med en cloud-baseret analysesoftware, se figur 3.

3 Teori og virkemåde

(a) Beer-Lamberts lov.

(b) Fotonisk krystal i nanoskala.   Figur 4: Virkemåde.

SpectroCuvette™ One er en banebrydende teknologi, der muliggør nøjagtige og pålidelige målinger af brydningsindeks ved hjælp af spektrofotometri og mærkningsfri spektroskopi. Det avancerede optiske filter, der består af fotoniske krystaller i nanoskala, giver præcis analyse af dæmpningsspektret. Med en avanceret optisk model i den cloud-baserede software SpectroWorks™ kan du med sikkerhed bestemme brydningsindeks og koncentration.

3.1 Absorbans via absorptionsspektroskopi

Som baggrund er Beer-Lamberts lov et velkendt princip i absorptionsspektroskopi, som gør det muligt at bestemme koncentrationen af et stof i en opløsning ud fra dets evne til at absorbere lys ved en bestemt bølgelængde, se figur 4.

I absorptionsspektroskopi relaterer Beer-Lamberts lov lysets dæmpning til egenskaberne ved det materiale, lyset passerer gennem:hvor A er absorbansen, ε er den molære ekstinktionskoefficient, C er koncentrationen, l er vejlængden, og A₀ er baggrundsabsorbansen.

3.2 Brydningsindeks via mærkningsfri spektroskopi

I mærkningsfri spektroskopi bruges lys til at undersøge egenskaberne ved fotoniske krystaller i nanoskala. Med SpectroCuvette™ One anvender softwaren en ny type optisk filter (optisk chip eller fotonisk krystal), som indsættes i lysstrålen, og spektrofotometeret måler brydningsindekset ved at måle et bølgelængde-/farveskift på x-aksen ved fast intensitet, som er proportionalt med koncentrationen eller prøveændringen i SpectroCuvette™ One, svarende til David B. Hands lov for proteiner [1]. Når lys vekselvirker med den fotoniske krystal, opstår der en resonans ved en specifik bølgelængde, som er relateret til brydningsindekset eller koncentrationen af materialet nær krystallens overflade. I den simpleste lineære model kan resonansbølgelængden, λR, beskrives med ligningen:hvor λ₀ er en referencebølgelængde, β er en koefficient, og nD er prøvens brydningsindeks. Ved at måle resonansbølgelængden kan brydningsindekset bestemmes. En omfattende beregningsmodel til at beregne brydningsindeks ud fra UV-Vis-spektre er indbygget i SpectroWorks™.

3.3 °Brix-skalaen

°Brix er en måleenhed, der bruges til at udtrykke sukkerindholdet i en flydende opløsning, typisk inden for føde- og drikkevareindustrien. Den er opkaldt efter den østrigske videnskabsmand Adolf Brix, som udviklede °Brix-skalaen. °Brix-værdien bestemmes ved at måle brydningsindekset af en opløsning og kan bruges til at estimere sukkerindholdet i en række væsker, f.eks. frugtjuice, vin og honning. Brydningsindekset er et mål for, hvor meget et stof bøjer lys, hvilket er relateret til dets koncentration og sammensætning. °Brix-skalaen korrelerer en opløsnings brydningsindeks med vægtprocenten af sukrose. For eksempel angiver en °Brix-værdi på 10, at opløsningen indeholder 10 % sukrose efter vægt. °Brix anvendes primært inden for frugtjuice, vinproduktion, sodavandsindustrien, stivelse og sukkerindustrien.

Opløsning af sukrose og andre sukkerarter i vand ændrer ikke kun dens massefylde, men også dens optiske egenskaber, især brydningsindekset og i hvilket omfang den drejer planet af lineært polariseret lys. Brydningsindekset, nD, for sukroseopløsninger ved forskellige masseprocenter er blevet målt og publiceret. Når brydningsindekset anvendes, kan °Brix-værdien fås fra den polynomiske tilpasning til ICUMSA-tabellen [2]:

hvor nD er brydningsindekset målt ved natrium-D-linjens bølgelængde (589,3 nm) ved 20 °C. Temperaturen er ofte vigtig og specificeres for en given måling, da brydningsindekset ændrer sig med temperaturen. Ovenstående ligning for °Brix-værdier er indbygget i SpectroWorks™.

4 Målinger, materialer og metoder

Dette afsnit beskriver målinger, materialer og metoder relateret til brugen af SpectroCuvette™ One. Bemærk følgende:

• Referencen med deioniseret vand og prøven bør måles i den samme kuvette.
• Hvis du genbruger den samme kuvette til yderligere prøvemålinger, anbefaler vi et vaske- og rensetrin (se vores anbefalede renseprotokol på vores website).
• Til højpræcisionsanvendelser anbefaler vi, at du bruger en ny kuvette med tilhørende referencemålinger af deioniseret vand for hver prøvemåling.

4.1 Materialer og udstyr

• Sukrose produktnr. S9378-500G fra Sigma Aldrich.
• Shimadzu-UV1800 dobbeltstråle-spektrofotometer.
• SpectroCuvette™ One brugt til målingerne. Til denne applikationsnote blev SpectroCuvette™ One med 15 mm strålehøjde brugt på grund af lysstrålens højde på 15-20 mm i et scannende spektrofotometer (UV1800).

4.2 Sikkerhedsforanstaltninger

• Følg almindelig laboratoriepraksis.
• Denne metode kræver ingen særlige sikkerhedsforanstaltninger.
• SpectroCuvette™ One er fremstillet af PMMA-plast og kan bortskaffes som plastaffald. 
  
  

4.3 Instrumentforberedelse

1. Start spektrofotometeret, og lad det varme op i 30 min.
2. Udfør Auto zero (uden kuvette).
3. Udfør System baseline (uden kuvette).

Vælg scan-metoden i spektrofotometeret med et bølgelængdeområde på 1100 nm – 190 nm (og de angivne parametre, f.eks. Shimadzu-UV1800 ‘slow-scan-mode’ med 2,0 nm bølgelængdeopløsning). 

4.4 Referencemåling

1. Tag SpectroCuvette™ One ud af æsken.
2. Tilsæt 3000 μL deioniseret vand.
3. Sørg for, at der ikke er luftbobler.
4. Notér æskenummer og kuvettenummer.
5. Mål side B af det deioniserede vand.
6. Tøm kuvetten, og lad den tørre.

Se figur 5 for de forskellige orienteringer af SpectroCuvette™ One. 

Figur 5: Metode til brug i et spektrofotometer. Side A/B-positioner og orienteringer af SpectroCuvette™ One til brug med kuvettebaserede UV-Vis-spektrofotometre med 1 cm vejlængde. Mål først i side A-positionen ved at indsætte SpectroCuvette™ One i instrumentets prøvekuvetteholder, så det optiske filter IKKE er i lysvejen (side A). Drej derefter SpectroCuvette™ One 90 grader til side B-positionen, så det optiske filter vender mod lyskilden, når det belyses (side B). Se vores UV-Vis-vidensbase for mere information om den specifikke orientering af lyskilde og detektor for forskellige UV-Vis-instrumentmodeller.

4.5 Prøveforberedelse

Ren sukrose opløses i deioniseret vand til en koncentration svarende til 50 °Brix.

En stamopløsning kan fremstilles således:

1. Afvej 50 g ren sukrose.
2. Tilsæt 50 g deioniseret vand.
3. Bland indtil opløsningen er fuldt opløst

 

Ud fra denne stamopløsning (50°Brix) fremstiller du en standardkurve ved seriefortynding fra 50 °Brix til 1,5625 °Brix med deioniseret vand, se tabel 1. Bland opløsningerne mellem fortyndingerne. 

4.6 Prøvemålinger på A- og B-side

Se figur 5 for de forskellige orienteringer af
SpectroCuvette™ One.
Vi fortsætter i den samme SpectroCuvette™ One, som blev brugt til referencemålingen med deioniseret vand.

Mål seriefortyndingen med stigende °Brix-værdi, startende ved den laveste °Brix-koncentration 1,5625 °Brix. Vask kuvetten mellem hver prøve.

1. Tilsæt 3000 μL af den fortyndede sukroseprøve.
2. Kontrollér, at der ikke er luftbobler.
3. Mål A-siden af prøven. (Mål uden at den fotoniske krystal vender mod lysvejen).
4. Mål B-siden af prøven. (Drej kuvetten 90 grader i forhold til lysvejen, og mål gennem den fotoniske krystal). 

4.6.1 Dataanalyse

1. Log ind på https://spectroworks.com/ (onlinesoftware).
2. Opret dit login og din adgangskode.

Opret et projekt, og opret samtidig resultatparametrene:

• ’Degrees Brix’
• ’Protein Concentration’
• ’Sample fit quality’
• ’Reference fit quality’

Tilføj alle disse parametre fra SpectroCuvette™ One til projektet. Når resultatparametrene tilføjes til projektet, bliver de synlige i den valgte resultatsektion. Udfør derefter følgende trin:

1. Når projektet er oprettet, kommer du til ”Get started with full spectrum analysis”.
2. Vælg SpectroCuvette™ One-funktionen.
3. Indtast den 6-tegns æskekode, der findes på bagsiden af SpectroCuvette™ One-æsken, og vælg kuvettenummeret.
4. Vælg fluidmateriale, H2O (optisk parameter for opløsningsmiddel) og acceptér.
5. Klik ”NEXT”.
6. Upload eller træk og slip B-side-spektret fra deioniseret vand over i SpectroWorks™.
7. Softwaren analyserer referencedata og indlæser resultater for ”Reference fit”. Klik ”NEXT”.
8. Upload eller træk og slip A-side-spektret fra prøven over i SpectroWorks™.
9. Upload eller træk og slip B-side-spektret fra prøven over i SpectroWorks™. Klik
   ”NEXT”.
10. Softwaren analyserer nu prøvedata og indlæser resultater for ”Sample fit”. Klik ”NEXT”.
11. Softwaren beregner nu “Degrees Brix” og indlæser resultater. Klik ”NEXT”.
12. Softwaren beregner nu “Protein Concentration” og indlæser resultater. Klik ”Finish”.
13. Til sidst indlæser softwaren oversigten og resultater for ”Summary”. Du kan tilføje alle oplysninger om målingen under ”Sample attributes”. Under ”Plots” kan spektrene ses. 

5 Resultater

Resultatafsnittet præsenterer de data, der er indhentet fra målingerne med SpectroCuvette™ One og analysen udført med SpectroWorks™-softwaren. Dataene fra en serie sukrosefortyndinger viser teknologiens evne til nøjagtigt at bestemme °Brix-værdier og sukrosekoncentrationer.

5.1 Reference- og prøvespektre

Figur 5 viser de to specifikke orienteringer af SpectroCuvette™ One, når den placeres i et spektrofotometer. Inputdataene til den online cloudsoftware SpectroWorks™ omfatter A-side- og B-side-spektrene fra både referencen (deioniseret vand) og prøvemålingerne. Figur 6a og 6b viser de forventede referencespektre for deioniseret vand. 

I A-side-spektret vekselvirker lyset udelukkende med det deioniserede vand. Da deioniseret vand ikke absorberer lys i det synlige område, er spektret fladt, som set i figur 6a. B-side-spektret, vist i figur 6b, opfanger resonansspektret af lys, der passerer gennem det optiske filter med den fotoniske krystal. Resonanstoppene mellem 750-700 nm (TE-mode) og 650-700 nm (TM-mode) skyldes lysets vekselvirkning med den fotoniske krystal og forventes i analysen. 

(a) Spektrum af deioniseret vand uden den fotoniske krystal (A-side).	(b) Spektrum af deioniseret vand med den fotoniske krystal vendt mod lysvejen tættere på lyskilden (B-side).
Figur 6: Eksempelspektre.

5.2 Standardkurve og °Brix-analyse

Standardkurven for sukrose blev opnået ved at måle en serie sukrosefortyndinger med SpectroCuvette™ One og analysere dataene med SpectroWorks™-softwaren. De resulterende °Brix-værdier og sukrosekoncentrationer blev bestemt og er vist i tabel 2. Figur 7 viser en grafisk sammenligning af resultaterne, som viser en stærk korrelation mellem de målte °Brix-værdier og de kendte sukrosekoncentrationer.

Resultaterne viser nøjagtigheden og pålideligheden af SpectroCuvette™ One-teknologien til at bestemme °Brix-værdier og sukrosekoncentrationer over et bredt koncentrationsområde. Den stærke korrelation mellem de målte og de kendte værdier, sammen med konsistensen i målingerne, understøtter, at teknikken er velegnet til forskellige anvendelser inden for føde- og drikkevareindustrien, forskning og kvalitetskontrol. 

6 Diskussion

De resultater, der er opnået med SpectroCuvette™ One og UV-Vis-spektrofotometeret, kombineret med SpectroWorks™-softwaren, viser en pålidelig og nøjagtig metode til at måle sukkerindhold som °Brix-indeks og sukrosekoncentration. SpectroCuvette™ One-teknologien overvinder flere begrænsninger ved traditionel refraktometri, herunder følsomhed over for luftbobler, partikler (eller andre urenheder), begrænset måleområde og behovet for hyppig kalibrering. Ved at bruge eksisterende spektrofotometerinstrumentering og cloud-baseret software giver denne metode dig mulighed for effektiv og præcis analyse uden behov for væsentlige forudgående investeringer eller omfattende oplæring. 

SpectroCuvette™ One-teknologien er særligt fordelagtig for producenter af fødevarer og drikkevarer, forskere og studerende, som har brug for en robust og nøjagtig metode til at bestemme sukkerindhold i opløsninger. Det brede brydningsindeksområde og ufølsomheden over for urenheder i prøven gør metoden velegnet til forskellige anvendelser, fra kvalitetskontrol i produktionsprocesser til forskning og udvikling af nye produkter.

Figur 7: Seriefortynding af sukrose og målt brydningsindeks.

Standardkurven for sukrosefortyndinger, som vist i tabel 2 og figur 7, viser en stærk korrelation mellem °Brix-indekset og målingerne af sukrosekoncentration. Denne korrelation viser nøjagtigheden og pålideligheden af SpectroCuvette™ One-teknologien til at bestemme sukkerindhold. Metoden kan også udvides til andre anvendelser, f.eks. måling af proteinkoncentration, ved at anvende mærkningsfri spektroskopi og justere parametrene i SpectroWorks™-softwaren tilsvarende. 

7 Konklusion

Sammenfattende er SpectroCuvette™ One et reelt alternativ til traditionel refraktometri til måling af sukkerindhold i opløsninger, specifikt via °Brix-indeks og måling af sukrosekoncentration. Teknologien udnytter eksisterende spektrofotometerinstrumentering og cloud-baseret software og sikrer nøjagtige og pålidelige resultater uden væsentlige investeringer eller omfattende oplæring. Metoden er velegnet til producenter af fødevarer og drikkevarer, forskere og studerende og kan udvides til andre anvendelser, f.eks. måling af proteinkoncentration, med mindre justeringer af softwareparametrene.

Ved at overvinde begrænsningerne ved traditionel refraktometri, såsom følsomhed over for urenheder og behovet for hyppig kalibrering, viser SpectroCuvette™ One sig at være et værdifuldt værktøj til at bestemme sukkerindhold i forskellige anvendelser. Det brede brydningsindeksområde og ufølsomheden over for urenheder gør teknologien særligt nyttig til kvalitetskontrol og forskning samt udviklingsformål på tværs af forskellige brancher.

Referencer

[1] David B. Hand. The refractivity of protein solutions. The Journal of Biological Chemistry,
108(3), 1935. 3.2 

[2]  ICUMSA Methods Book. op. cit. edition. Specification and Standard SPS-3 Refractometry and
Tables – Official; Tables A-F. 3.3