Applikationsnoter

Dråber og mikrovolumen-prøveanvendelser til SpectroCuvette™ One

Mikrovolumenprøver på omkring 0,5 µL kan måles billigt i et konventionelt UV-Vis-spektrofotometer ved at dosere en dråbe og flade den ud på det optiske filter i SpectroCuvette™ One.

INDS_20201016_SpectroCuvette_One_Product_brief_Figure_02_high_res

Figur 1. Fotografi af en lavvolumen-dråbe udfladet med et dækglas til analyse i et spektrofotometer.

Evnen til nøjagtigt at måle koncentrationer af prøver med lavt volumen uden fortynding af den oprindelige stamopløsning er meget ønskværdig i mange anvendelser, f.eks. DNA-, RNA- og proteinkoncentrationer samt celletælling i fermentering. Det sparer reagenser, forebygger fortyndingsfejl og giver et koncentrationsestimat ud fra et lille, repræsentativt prøvevolumen.

Tabel 1. Liste over småvolumen-/mikrovolumen-/nanovolumen-UV-Vis-spektrofotometre [1].

	Model	Mærke	Volumen
1	SpectraMax QuickDrop MicroVolume Spectrophotometer	Molecular Devices LLC	0,5 µL
2	QIAxpert Instrument	QIAGEN	2 µL
3	BioSpec-nano Micro-volume Spectrophotometer	Shimadzu	1-2 µL
4	ScanDrop2 Nano-volume spectrophotometer	Analytik Jena	0,3 µL-2 mL
5	DS-11 Spectrophotometer	DeNovix Inc	0,5-1 µL
6	NanoDrop™ One Spectrophotometer	Thermo Fischer	2 µL
7	Colibri Microvolume Spectrometer	TitertekBerthold	1-5 µL
8	Spectrophotometer UV5Nano	MettlerToledo	1 µL
9	NanoPhotometer®	Implen	5 µL
10	BioDrop µLITE	BioDrop	0,5 µL

Med den teknologiske udvikling er spektrofotometre til lavt volumen blevet tilgængelige. Disse dyre instrumenter muliggør målinger på 0,5 µL til 5 µL i kapillærformater, pladelæsere eller »nano«-spektrofotometre. Tabel 1 viser en liste over modeller, der kan måle små volumener. Hvis du har brug for både højt og lavt volumen, kræves der ofte forskelligt udstyr.

I denne applikationsartikel beskrives en metode til at måle prøver med lavt volumen omkring 0,5 µL ved hjælp af et konventionelt spektrofotometer med en 2 mL-kuvetteholder til højt volumen og SpectroCuvette™ One, se figur 1. DI-vand og sukroseopløsning bruges til at demonstrere metodens gyldighed og begrænsninger.

Måleprincip

Direkte, mærkningsfri bestemmelse af en prøves koncentration kan ske ved at måle ændringen i opløsningens iboende egenskab, brydningsindekset. Traditionelt har et refraktometer været nødvendigt for at bestemme brydningsindekset. Den nye SpectroCuvette™ One har et indbygget optisk filter, som gør det muligt at måle brydningsindeks med et konventionelt
spektrofotometer.

Typisk kræver de fleste analytiske refraktometre omkring 100-300 µL prøvevolumen for nøjagtigt at måle brydningsindekset af flydende prøver. I tabel 2 vises en liste over refraktometre.

Tabel 2. Liste over småvolumen-/mikrovolumen- og håndholdte refraktometre.

	Model	Mærke	Volumen
1	Abbemat 3X00 Compact Refractometers (Tabletop) [2]	Anton Paar	200 µL
2	Model 2010/M (Bulk Material or Thick Film Index/Birefringence Measurement) [3]	Metricon
3	Ultra Low Volume Refractometer (Tabletop) [4]	Rudolph Research Analytical	10 µL
4	ABBE refractometer AR12 [5]	Schmidt-Haensch	300 µL
5	Easy Brix, Easy R40 [6]	Mettler Toledo	200 µL
6	Eclipse Professional Optical Refractometers (Hand held Brix) [6]	Bellingham-Stanley	< 1 µL
7	OPTi Digital Refractometers / Hand-held) [6]	Bellingham-Stanley
8	E-line Economy Optical Refractometers [6]	Bellingham-Stanley
9	AR200 [7]	Reichert/Ametek	100 µL
10	Digital and Analog [8]	ATAGO

Håndholdte, bærbare refraktometre findes og bruges til at bestemme forskellige sukkerkoncentrationer (Brix) med meget lille prøvevolumen, i nogle tilfælde endda under 1 µL. Disse håndholdte instrumenter egner sig dog ikke til alle anvendelser af brydningsindeksmåling, især ikke analytiske målinger af forskellige koncentrationer eller kinetik for biomolekyler som DNA, proteiner, RNA osv., hvor renhed, kontamineringsrisiko, præcision, dokumentation og dataintegritet er vigtige.

Med SpectroCuvette™ One og et spektrofotometer med 10 mm lysvej kan du måle prøver med lavt volumen ved at dosere dem som dråber med en pipette direkte på det optiske filter og derefter flade dem ud med et egnet gennemsigtigt objekt, f.eks. et dækglas, se figur 1.

ILLU_20200724_Droplet_Coverslide_skecth_All_426x426 Figur 2. Skitse af korrekt brug. a) Dækglasposition ved 15 mm strålehøjde. b) Dækglasposition ved 8,5 mm strålehøjde. c) Dårlig justering af dækglasset. d) Optisk filter belyst af strålen og ikke dækket af prøve giver skyggesignaler i spektret.

Det grundlæggende princip i at flade en prøvedråbe ud med et dækglas sikrer, at instrumentets optik måler den samme filterrespons som med en fuld 2 mL-væskesøjle i kuvetten. Da dråben desuden har lille volumen, sørger overfladespændingen for, at den udfladede dråbe og dens dækglas bliver siddende, også ved lodrette kuvettemålinger. Figur 2a og 2b viser korrekt brug ved henholdsvis 15 mm og 8,5 mm, som er industriens standarder for optisk strålehøjde i et spektrofotometer.

Figur 2c og 2d understreger, hvor vigtigt det er at justere og placere prøven og dækglasset korrekt i forhold til det optiske filter og instrumentets optik. Moderne CCD-array-spektrofotometre har ofte en smal lysstråle, som typisk ligger inden for det optiske filters og et 6 mm-dækglas’ grænser. For konventionelle scannende instrumenter overskrider lysstrålens bredde derimod ofte disse grænser, som skitseret i figur 2c, og skyggesignal fra luftspalte-grænseflader kan optræde i spektret.

I figur 3 ses målinger af brydningsindeksværdierne for DI-vand og 5 % sukrose med smalstråleudstyr. De beregnede RI-værdier er målt til 1,333 for DI-vand og 1,339 for 5 % sukrose, hvilket viser et tæt match mellem målingerne med SpectroCuvette™ One og et konventionelt refraktometer (Kern Optics ORD 85BM).

Konsekvenserne af ikke at følge principperne i figur 2a og 2b ses i figur 4 og 5. Hvis du f.eks. udfører dråbemålingen uden dækglas, opstår der krumning af dråben og begrænset prøvedækning af filteret ved bredstråleoptik, hvilket giver skyggesignaler i spektret, se den røde cirkel i figur 4, og dårlig modeltilpasning med en tilpasningskvalitet på kun 25 %. Generelt bør tilpasningskvaliteten i softwaren være 80 % eller højere.

Prøvedækning af det optiske filter og justerede flader i den optiske vej forbedrer spektret og dermed tilpasningskvaliteten. Sammenlignet med måling uden dækglas tilpasses udfladede 10 µL-dråbemålinger bedre til den optiske model, se figur 5. Der kan dog stadig ses et skyggesignal, som indikerer en luftspalte på grund af dråbekrumning, som den ellers høje tilpasningskvalitet på 85 % ikke fanger, og du skal være forsigtig, når du fortolker sådanne resultater. Generelt er problemer med skæv justering og placering lettere at undgå ved mindre dråber under 1 µL, også ved bredstråleoptik. For 0,5 µL-prøvedråber giver den højere korrelation mellem spektre og tilpasningsmodel resultater tættere på 2 mL-brydningsindeksmålingerne, se figur 6 og figur 7.

Sikkerhedsforanstaltninger

Denne metode kræver ingen særlige sikkerhedsforanstaltninger. Følg almindelig laboratoriepraksis. Denne billige metode kræver ikke nyt hardware eller instrumentering i form af et lavvolumen-spektrofotometer eller et refraktometer. Den nye SpectroCuvette™ One udvider funktionaliteten af eksisterende konventionelle spektrofotometre og deres teknikker, baseret direkte på det globale standardformat med 2 mL-kuvette.

Måling

Materialer og apparatur

Sukrose (Sigma produktnr. 84100) blev brugt til at fremstille en sukroseopløsning med DI-vand. Glasdækglas med 6 mm diameter og 0,15 mm tykkelse blev brugt til at flade dråber ud og sikre en ensartet krumning. Ocean Optics Red Tide USB-650UV (smalstråleoptik), Ocean Optics specialdesignet Flame S (smalstråleoptik) og Shimadzu UV-1800 (bred 6 mm-stråleoptik) blev testet.

Prøveforberedelse

Til fremstilling af en 5 % sukroseprøve blev der fremstillet en opløsning ved at opløse 2,5 g sukrose (Sigma produktnr. 84100) i 50 mL DI-vand.

Måleprocedure

Tænd spektrofotometeret og computeren, og åbn den online SpectroCuvette™ One-software i en webbrowser. Brug SpectroCuvette™ One til brydningsindeksmålingerne, og følg softwarevejledningen for hver måling. Til hver måling blev en dråbe på 0,5 µL doseret på det optiske filter inde i SpectroCuvette™ One, både for blank DI-vand og for sukroseopløsningen. Efter dosering af hver dråbe blev et glasdækglas lagt oven på dråben. Dækglasset bliver siddende på grund af prøvens overfladespænding.