Enzymer og kinetik

Enzymer og deres aktivitet 

Enzymer er biomolekyler, der produceres i levende organismer. De fungerer som biokatalysatorer og sætter fart på specifikke biokemiske reaktioner. Biokemiske reaktioner er kemiske reaktioner, der foregår i den levende celle, ofte med hjælp fra enzymer. Som katalysator kan et enzym facilitere den samme kemiske reaktion uden selv at blive forbrugt. Enzymer er proteiner og består af lange kæder af specifikke aminosyresekvenser, som folder sig til deres unikke form. Enzymer har en kløft kaldet det aktive site, som er den del af enzymet, som substrater binder til. Når et substrat er i nærheden, danner enzymet en komplementær form til substratet for at binde det. Enzymernes processivitet bestemmes af deres aktivitet, eller det antal enheder af substrat de kan danne fra en reaktant.

Hexokinase er et meget vigtigt enzym, da det er det første enzym i levende celler, der nedbryder glukose (glykolyse) for at danne energi. Det omdanner glukose til glukose-6-fosfat. Denne omdannelse af glukose er det hastighedsbestemmende trin i glykolysen i celler. Hexokinaseaktiviteten falder hurtigt, efterhånden som normale røde blodlegemer ældes, og er en vigtig parameter at undersøge ved hæmolytiske sygdomme som anæmi.

Aktivitetsbestemmelse 

Den kvantitative måling af hexokinaseassay udføres konventionelt med absorbans-, fluorescens- eller kolorimetriske metoder. I en hexokinaseassayprotokol omdannes glukose først til glukose-6-fosfat i reaktion med ATP. Produktet af den første reaktion, glukose-6-fosfat, oxideres derefter til 6-fosfoglukonat i nærvær af NAD+ af enzymet glucose-6-phosphate dehydrogenase, hvorved der dannes 6-fosfoglukonat og NADH.

                GLUCOSE + ATP → GLUCOSE-6-PHOSPHATE + ADP

GLUCOSE-6-PHOSPHATE + NAD+ → 6-PHOSPHOGLUCONATE + NADH

Mængden af dannet NADH hjælper med at bestemme enzymets koncentration og aktivitet. Dette overvåges sædvanligvis ved at måle den iboende fluorescens af NADH3 eller et farvet produkt4. SpectroCuvette™ One kan direkte måle kinetikken af hexokinaseenzymreaktionen label-fri via ændringer i brydningsindeks over tid under reaktionen (Figur 1).   Figur 1. Relativ ændring i brydningsindeks vs. tid som følge af hexokinases enzymatiske virkning på glukose  

Princip 

Direkte label-fri detektion af enzymatisk aktivitet med et substrat kan overvåges via ændringen i opløsningens iboende egenskab, brydningsindeks, efterhånden som produkt dannes over tid. Traditionelt har et refraktometer været nødvendigt til bestemmelse af brydningsindeks.

Den nye SpectroCuvette™ One har et indbygget optisk filter, der gør det muligt at måle ændring i brydningsindeks som følge af enzymatisk reaktion i realtid med et konventionelt spektrofotometer.

 

Sikkerhedsforanstaltninger

Denne metode indebærer ingen særlige sikkerhedsforanstaltninger. Følg almindelig laboratoriepraksis.

Måling

1. Materialer og apparatur 
   
   Glucose (HK) Assay Kit5 fra Sigma-Aldrich (product code GAHK-20) blev anvendt. Der kræves et konventionelt spektrofotometer med mulighed for at indsamle data i realtid, en SpectroCuvette™ One og en computer med internetadgang.
   
   
2. Prøveforberedelse
   
   Reagenset fra Glucose (HK) Assay Kit5 blev rekonstitueret i henhold til producentens anvisninger i 20 mL DI-vand. Til hver måling blev der brugt 1.8 mL reagens. Standardglukoseopløsninger blev fremstillet med 40 μl og 80 μl, tilsat DI-vand til 200 μl og derefter tilsat SpectroCuvette™ One til et samlet volumen på 2 mL.
   
   
3. Måleprocedure
   
   Spektrofotometeret og computeren tændes, og den online SpectroCuvette™ One-software åbnes i en webbrowser. SpectroCuvette™ One (Figur 2) bruges til målingerne af brydningsindeks vs. tid efter softwarevejledningen for hver måling. For hver måling viser softwaren enzymopløsningens brydningsindeks, og dette kan vises med datapunkter for tidsintervaller eller andre variable afhængigt af dit valg.
    
   
   

Referencer

1. www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular biology/hexokinase.
2. Jepsen S.T, Jørgensen T.M, Sørensen H.S, Kristensen S.R, 2019, Real-Time Interferometric Refractive Index Change Measurement for the Direct Detection of Enzymatic Reactions and the Determination of Enzyme Kinetics. Sensors, 19, 539.
3. www.jenway.com/adminimages/A10_010A_Kinetics_of_hexokinase_using_NNAD_fluorescence.pdf.
4. www.abcam.com/ps/products/136/ab136957/documents/ab136957%20HeHexokina%20Assay%20Kit%20proto-col%20v6%20(website).pdf
5. www.sigmaaldrich.com/con-tent/dam/sigmaaldrich/docs/Sigma/Bulletin/gaga20bul.pdf.

   

Figur 2. SpectroCuvette™ One måler brydningsindeks og absorbans for den samme prøve og bruger kun et konventionelt spektrofotometer og den online SpectroCuvette™-software.