Proteiner
Proteiner er makromolekyler, der består af en eller flere kæder af aminosyrer. Det menneskelige genom specificerer 20 forskellige aminosyrer. Rækkefølgen af disse er den primære differentierende faktor for proteiner og påvirker deres foldning til specifikke tredimensionelle strukturer. Proteiner udfører et stort udvalg af vitale funktioner i organismer, herunder katalyse, transport og signaloverførsel. Derudover produceres mange proteiner industrielt til en række anvendelser, herunder lægemidler.
Koncentrationsbestemmelse
Et udvalg af bioassays er tilgængelige til at bestemme koncentrationen af oprenset protein. Disse bioassays kræver imidlertid, at eksperimentatoren laver en standardkurve, som, hvis det samme protein bruges, kan være meget dyrt, og hvis et andet protein bruges, kan medføre store systematiske fejl. Alternativt kan nogle proteiner kvantificeres ved absorptionsspektroskopi. Nogle få aminosyrer (tryptophan, tyrosine og phenylalanine) er aromatiske og absorberer UV-lys ved 280 nm. Afhængigt af mængden af aromatiske aminosyrer, et protein består af, vil det absorbere mere eller mindre lys ved 280 nm, dvs. have en højere eller lavere ekstinktionskoefficient. Ekstinktionskoefficienten kan beregnes teoretisk, men dette kan give værdier, der afviger med op til 10 %. Alternativt kan den bestemmes eksperimentelt. Dette kræver, at der laves en standardkurve for det specifikke protein på det specifikke spektrofotometer.
Hvorimod proteiners ekstinktionskoefficienter varierer stærkt, er det vist, at proteiner har meget ens værdier for inkrement af brydningsindeks, dvs. proteinets brydningsindeks afhængighed af proteinkoncentration. Dermed er måling af proteinets brydningsindeks en hurtig og nem måde at få proteinkoncentrationen uden at skulle lave en standardkurve. Som en yderligere fordel gør denne metode det også muligt at kvantificere dit protein direkte uden forudgående fortynding.
Figur 1. Sensorsvaret, vist som brydningsindeks, er lineært proportionalt med BSA-koncentrationen, hvilket den gratis software vil vise.
Princip
Traditionelt har et specialiseret refraktometer været påkrævet til bestemmelse af brydningsindekset. Med den innovative SpectroCuvette™ One er der imidlertid installeret en nanosensor i en kuvette, så bestemmelse af brydningsindekset kan udføres i et standardspektrofotometer. På den måde kan selv proteiner med få eller ingen aromatiske residualer måles med et konventionelt spektrofotometer.
Sikkerhedsforanstaltninger
Denne metode indebærer ingen sikkerhedsforanstaltninger. Følg almindelig laboratoriepraksis.
Måling
- Materialer og apparatur
Det eneste apparatur, der kræves, er et standardspektrofotometer og en computer med internetadgang. Til hver måling kræves en SpectroCuvette™ One. - Prøveforberedelse
Bovine serum albumin (BSA) opløses i phosphate buffered saline (PBS) ved en koncentration på 100 mg/mL. Når den er fuldt opløst, seriefortyndes stocken i PBS fra 100 til 0.2 mg/mL. - Måleprocedure
Spektrofotometeret og computeren tændes, og den gratis SpectroCuvette™ One-software åbnes. Til hver prøve bruges en ny SpectroCuvette™ One i henhold til softwarevejledningen. Efter den sidste måling præsenterer softwaren dataene som absorbans, brydningsindeks eller koncentration, afhængigt af eksperimentatorens foretrukne valg af repræsentation (Figur 1).
Referencer
- Zhao H, Brown P. H. and Schuck P. 2011, On the Distribution of Protein Refractive Index Increments. Biophysical Journal, 100, 2309-2317
Figur 2. SpectroCuvetteTM One måler brydningsindeks og absorbans på den samme prøve og bruger kun et standardspektrofotometer og den gratis SpectroCuvetteTM One-software.