Traditionelt anvender måling af proteinkoncentration Beer-Lambert law, som siger, at koncentrationen er direkte proportional med absorbans-forskydningen ved en fast bølgelængde. Den praktiske gennemførelse af dette kan være vanskelig.
En alternativ måde at beregne proteinkoncentrationer på er at udnytte Hand’s Law. Brydningsindekset for en proteinopløsning er direkte proportionalt med dens koncentration.
Lign. 1 Hand’s Law
nₚₛ er brydningsindekset for proteinopløsningen, nₛ er brydningsindekset for opløsningsmidlet, a er en proportionalitetskonstant, som undertiden kaldes refractive index increment, og C er koncentrationen af opløsningen. [1]
Brydningsindeks-inkrementet, a, er en vigtig parameter til koncentrationsbestemmelse af et protein. Man kan opløse et protein i et kendt opløsningsmiddel og udføre en række fortyndinger for at beregne denne værdi a ud fra brydningsindeksmålingerne af fortyndingerne.
Et eksempel på en eksperimentel procedure, der demonstrerer proteinkvantificering med et spektrofotometer og udnytter Hand’s Law, kan findes her. Et af resultaterne fra denne artikel er vist nedenfor i Figur 1.
Fig. 1 Bestemmelse af proteinkoncentration. De røde punkter (SpectroCuvette™ One i VWR UV6300-PC) er beregnet med en procedure, der anvender Hand’s Law. Omvendt anvender de blå punkter (Nanodrop built-in BSA ext. coeff E1%) Beer-Lambert law.
Med et UV-Vis-spektrofotometer, ved brug af SpectroCuvette™ One sammen med SpectroWorks™-software, kan koncentrationsmålinger foretages fra prøvestørrelser ned til 0.5μL og et bredt koncentrationsområde på 0.02 – 300 mg/mL.
Interesseret i, hvordan du kan opgradere dine eksisterende UV-Vis-spektrofotometre og nemt strømline og automatisere din dataanalyse? Læs mere her.
Referencer