Whitepaper: Proteinkvantificering med spektrofotometer, SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ sammenlignet med mikrovolumen-system

Sangita Khatri¹, Thomas Tølbøl Sørensen¹, Arpita De¹, Emil Højlund-Nielsen¹, Jesper Uhd²

¹Alontia, Copenhagen, Hørmarken 2, DK-3520 Farum, Denmark

²Technical University of Denmark, Department of Chemistry, Kemitorvet 206, 2800 Kongens Lyngby, Denmark

Udgivet 21. juli 2021

Nøgleord

Protein, UV-Vis-spektrofotometer, SpectroCuvette™, SpectroWorks™, brydningsindeks, brydningsindeks-inkrement, Bovine Serum Albumin, BSA

Resumé

Nøjagtig kvantificering af det samlede proteinindhold i en prøve eller et formuleret produkt er vigtig i adskillige brancher som bioteknologi, lægemidler, kemi og fødevarer samt i forskning. Her viser vi, at proteinkvantificering kan udføres på få sekunder med kun et kuvettebaseret UV-Vis-spektrofotometer og den nye SpectroCuvette™ One med software. Den unikke kuvette med kalibreret optisk filter bruges til at kvantificere Bovine Serum Albumin (BSA)-proteinkoncentrationer fra 5 mg/mL til 200 mg/mL i vandig opløsning ved hjælp af brydningsindeks, og metoden sammenlignes med industristandarder. Det vises, at denne direkte mærkningsfrie detektionsmetode giver øget følsomhed og pålidelighed ved proteinkvantificering for både mikroliter- og milliliter-prøvevolumener. Tilgangen med at opgradere kuvetteprøveholderen med ny teknologi, frem for selve instrumentet, reducerer behovet for dedikeret mikrovolumen-instrumentering og åbner for, at eksisterende ældre udstyr fortsat kan komme både uddannelse, forskning og industri til gode.

Indledning

Proteiner er de mest diverse og mest udbredte molekyler og spiller en vigtig rolle i næsten alle typer biologiske processer, herunder levering af næringsstoffer til celler, balance af plasma-pH, immunologiske processer og forbedring af de farmakokinetiske egenskaber af lægemiddelmolekyler i biologiske miljøer. Proteomik har potentialet til at løse de manglende brikker i life science-forskningen[1,2]. Den omfattende brug af proteomikplatformen skaber behov for præcis og hurtig kvantificering af proteiner. Et udvalg af bioassays, herunder kolorimetriske assays, Qubit-assays og andre, er tilgængelige til at bestemme koncentrationen af oprenset protein. Alternativt er mikrovolumen-absorbansspektroskopi et af de populære valg blandt forskere, da det er enkelt, hurtigt og kan kvantificere mikrovolumenprøver.

Som et alternativ til disse etablerede metoder bruger SpectroCuvette™ One en unik optisk teknologi, der bøjer lysstrålen, hvilket gør det muligt at kvantificere stoffer i kontakt med det optiske filter[3,4,5,6,7,8].

Derudover analyserer den tilhørende software, SpectroWorks™, automatisk spektret, korrigerer for optisk vej og kuvettefejljustering ved at tilgå 200 millioner kalibreringspunkter og giver resultatet tilbage til dig på under 5 sekunder. Denne digitale laboratorieplatform er enkel at betjene og er forudkalibreret, dækker prøvevolumen fra 0.5 µL til 3 mL og giver mærkningsfri analytmåling med en cloud-baseret softwareløsning og sikker datalagring og -sporing. Denne applikationsnote beskriver, hvordan du bruger denne nye teknologi til proteinkvantificering.

Traditionelt udføres måling af proteinkoncentration ved farveintensitetsskift på y-aksen ved absorbans eller fluorescens ved en fast bølgelængde, og den er baseret på Beer-Lamberts lov. Beer-Lamberts lov relaterer dæmpningen af lys til egenskaberne af det materiale, lyset passerer igennem:

A = εcl + A0,   

hvor A er absorbansen, ε er den molære ekstinktionskoefficient, c er koncentrationen, l er vejlængden, og A0 er baggrundsabsorbansen. Mærkningsfri måling med SpectroCuvette™ One og software bruger en ny type optisk filter, som indsættes i lysstrålen, og spektrofotometeret måler analytens brydningsindeks ved at måle et bølgelængde-farveskift på x-aksen ved fast intensitet, som er proportionalt med analytkoncentrationen eller prøveændringen i kuvetten. SpectroWorks™ er baseret på Hands lov[9], og lineariteten beskrives som:

nps = aC + ns,

hvor nps er proteinopløsningens brydningsindeks, ns er opløsningsmidlets brydningsindeks, a er proteinets specifikke brydningsindeks-inkrement, og C er proteinopløsningens koncentration.

Brydningsindeks-inkrementet, dn/dc, for proteiner er en af de vigtige parametre til koncentrationsbestemmelse, herunder biofysisk karakterisering af proteiner og proteinkomplekser. Desuden forbedres forståelsen af forskellige optiske egenskaber, struktur og funktion af forskellige proteiner ved at kende det molekylære brydningsindeks[9].

Atomernes og de kemiske gruppers polariserbarhed i molekylet bestemmer partiklernes brydningsindeks, og derfor er aminosyresammensætningen i proteinerne den primære determinant for proteinets brydningsindeks. Denne analytiske værdi er blevet anvendt i vid udstrækning i forskellige refraktometriske målinger af proteinkoncentration ved analytisk ultracentrifugering, overfladeplasmonresonans og andre mærkningsfrie analytiske metoder[9,10]. Forskellige tekniske og prissmæssige begrænsninger har dog gjort det vanskeligt at opnå nemme, hurtige og pålidelige målinger tidligere. SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ sammen med spektrofotometeret udgør en hurtig, omkostningseffektiv, pålidelig og enkel proteinkvantificeringsteknik over et bredt synligt bølgelængdeområde ved hjælp af brydningsindeks. Denne applikationsnote beskriver den detaljerede protokol og ydelsesdata, herunder Nanodrop-referencemålinger, for Bovine Serum Albumin (BSA).

Nødvendige materialer

1. Spektrofotometer
2. SpectroCuvette™ One
3. SpectroWorks™
4. Bovine Serum Albumin
5. Dækglas
6. Triton X

Bemærk: Håndtering, opbevaring og brug af SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ skal udføres i overensstemmelse med produktspecifikationen og introduktionsvideoerne leveret af cphnano.

Eksperimentelle protokoller

1.     Mikrovolumen-koncentrationsmålinger

1.     Klargøring af fortyndet Bovine Serum Albumin

Opløs Bovine Serum Albumin (BSA) i deioniseret (DI) vand ved en koncentration på 200 mg/mL. Brug det samme fortyndingsmiddel som i stamopløsningen til at fremstille serien af fortyndede BSA-standardopløsninger som beskrevet i Tabel 1.

2.     Behandling af SpectroCuvette™ One og dækglas med Triton X-opløsning

0.001% Triton X-opløsning er blevet brugt til at reducere uspecifik binding af proteiner til optisk filter og dækglas. Læg SpectroCuvette™ One og dækglas i blød i 0.001% Triton X-opløsning i fem minutter, og lad dem tørre helt.

3. Protokol for kørsel af proteinprøve med SpectroCuvette™ One og spektrofotometer.

1. Tænd spektrofotometeret, og lad det stabilisere i mindst 15 minutter, før du kører nogen prøver. Forbered dine prøver i denne opvarmningstid.
2. Pipettér 0.5 µL referenceløsning, DI-vand, i bunden af det 0.001% Triton X-behandlede optiske filter. Læg dækglasset oven på referencedråben, og juster det med pipettespidsen. Se instruktionsvideoen her.
3. Indsæt kuvetten med referencedråben i spektrofotometerets prøvekammer. Kør først B-side-målingen, og gem spektret; drej derefter kuvetten 90 grader, og registrer A-side-målingen. Se bekræftelsesdetaljer for B- og A-side her.
4. Fjern dækglasset efter referencemålingen, og dryp 0.5 µL proteinprøve i bunden af det optiske filter med en velkalibreret pipette. Læg dækglasset oven på proteinopløsningsdråben, og juster det med pipettespidsen.
5. Indsæt prøvekuetten i spektrofotometerets prøvekammer. Kør og gem først B-side-målingsspektret; drej derefter kuvetten 90 grader, og registrer A-side-målingen.

4.     Dataanalyse i SpectroWorks™

1. Opret en brugerprofil, og log ind på https://app.spectroworks.com/. Se også den detaljerede vejledning i at bruge SpectroWorks™ her.
2. Opret projektmappen, og vælg vigtige parametre, herunder proteinkoncentration. Indtast den specifikke brydningsindeks-inkrementværdi for proteinet og referencelvæskens brydningsindeks. 0.1650 mL/g bruges for Bovine Serum Albumin[11].
3. Gå til opret-indstillingen, og vælg kuvettetype SpectroCuvette™. Indtast bokskoden og kuvettenummeret, og klik næste.
4. Referencemåling af brydningsindeks: Vælg referencelvæsken, som i de fleste tilfælde er vand. Træk og slip referencemålingen af vand B-side, klik næste, og træk og slip prøve B-side, som er vand ved referencemåling; træk derefter og slip A-side-målingen, og afslut.
5. Gentag trin 3.
6. Måling af proteinkoncentration: Vælg referencelvæsken, træk og slip referencemålingen af vand B-side, og klik næste. Træk og slip henholdsvis prøve B-side og A-side, som i dette tilfælde er Bovine Serum Albumin, og afslut. Læs mere om mikrovolumenmålinger her.

2.   Koncentrationsmålinger af 3 mL proteinprøvevolumen

1.     Klargøring af fortyndet Bovine Serum Albumin

Klargør 0.001% Triton X-opløsning. Opløs Bovine Serum Albumin (BSA) i 0.001% Triton X-opløsning ved en koncentration på 200 mg/mL. Brug det samme fortyndingsmiddel som i stamopløsningen til at fremstille serien af fortyndede BSA-standardopløsninger som beskrevet i Tabel 2.

2. Protokol for kørsel af 3 mL proteinprøve med SpectroCuvette™ One og spektrofotometer

1. Tænd spektrofotometeret, og lad det stabilisere i mindst 15 minutter, før du kører nogen prøver. Forbered dine prøver i denne opvarmningstid.
2. Pipettér 3 mL reference-DI-vand i SpectroCuvette™
3. Indsæt referenceprøvekuetten i spektrofotometerets prøvekammer. Kør først B-side-målingen, og gem spektret; drej derefter kuvetten 90 grader, og registrer A-side-målingen.
4. Fjern referencelvæsken efter referencemålingen, og pipettér 2.5 mL 0.001% Triton X-opløsning i den samme kuvette med en velkalibreret pipette.
5. Indsæt kuvetten fyldt med 0.001% Triton X i spektrofotometerets prøvekammer. Kør og gem først B-side-målingsspektret; drej derefter kuvetten 90 grader, og registrer A-side-målingen.
6. Pipettér 3 mL proteinprøve i den samme kuvette. Kør og gem først B-side-målingsspektret for proteinprøven; drej derefter kuvetten 90 grader, og registrer A-side-målingen for proteinprøven.

3.     Dataanalyse i SpectroWorks™

1. Opret en brugerprofil, og log ind på https://app.spectroworks.com/.
2. Opret projektmappen, og vælg vigtige parametre, herunder proteinkoncentration. Indtast den specifikke brydningsindeks-inkrementværdi for proteinet og referencelvæskens brydningsindeks, som i dette tilfælde er 0.001% Triton X. 0.1650 mL/g bruges for Bovine Serum Albumin.
3. Gå til opret-indstillingen, og vælg kuvettetype SpectroCuvette™. Indtast bokskoden og kuvettenummeret, og klik næste.
4. Referencemåling af vands brydningsindeks: Vælg referencelvæsken, som i de fleste tilfælde er vand. Træk og slip referencemålingen af vand B-side, klik næste, og træk og slip prøve B-side, som er vand ved referencemåling; træk derefter og slip A-side-målingen, og afslut.
5. Gentag trin 3.
6. Referencemåling af 0.001% brydningsindeks: Vælg referencelvæsken, som i dette tilfælde er vand. Træk og slip referencemålingen af vand B-side, klik næste, og træk og slip prøve B-side, som er 0.001% Triton X ved referencemåling; træk derefter og slip A-side-målingen, og afslut.
7. Måling af proteinkoncentration: Gå til rediger projekt, og tilføj det opnåede brydningsindeks for 0.001% Triton X i kolonnen for referencebrydningsindeks. Vælg referencelvæsken, træk og slip referencemålingen af 0.001% Triton X B-side, og klik næste. Træk og slip henholdsvis proteinprøve B-side og A-side, og afslut.

3.     Nanodrop-måling

Nanodrop-måling blev udført på Danmarks Tekniske Universitet, Institut for Kemi, med Nanodrop 1000. Nanodrop-manualen blev fulgt til proteinkvantificering med masse-ekstinktionskoefficienten 6.7 ved 280 nm for en 1% (10 mg/mL) BSA-opløsning. Fortyndingsserierne i Tabel 1 og 2 blev brugt til kvantificering af BSA-koncentration.

Tabel 1: Fortyndinger til mikrovolumen-proteinkoncentrationsmålinger.

Rørnummer	Stamvolumen	Tilsat fortyndingsmiddel	Endeligt volumen	Endelig BSA-koncentration mg/mL
1.	100 µL	0	100 µL	200mg/mL
2.	75 µL	25 µL	100 µL	150 mg/mL
3.	50 µL	50 µL	100 µL	100 mg/mL
4.	40 µL	60 µL	100 µL	80 mg/mL
5.	30 µL	70 µL	100 µL	60 mg/mL
6.	20 µL	80 µL	100 µL	40 mg/mL
7.	10 µL	90 µL	100 µL	20 mg/mL
8.	5 µL	95 µL	100 µL	10 mg/mL
9.	0	100 µL	100 µL	0 mg/mL

Tabel 2: Fortyndinger til 3mL-proteinkoncentrationsmålinger

Rørnummer	Stamvolumen	Tilsat fortyndingsmiddel	Endeligt volumen	Endelig BSA-koncentration mg/mL
1.	3 mL	0	3 mL	200 mg/mL
2.	2.25 mL	0.75 mL	3 mL	150 mg/mL
3.	1.5 mL	1.5 mL	3 mL	100 mg/mL
4.	1.2 mL	1.8 mL	3 mL	80 mg/mL
5.	0.9 mL	2.1 mL	3 mL	60 mg/mL
6.	0.6 mL	2.4 mL	3 mL	40 mg/mL
7.	0.3 mL	2.7 mL	3 mL	20 mg/mL
8.	0.15 mL	2.85 mL	3 mL	10 mg/mL
9.	0.075 mL	2.925 mL	3 mL	5 mg/mL
10.	0	3 mL	3 mL	0 mg/mL

Resultater

Med den ovennævnte protokol blev koncentrationen af Bovine Serum Albumin målt med SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ på et spektrofotometer. Valideringsmålingen blev desuden udført på Danmarks Tekniske Universitet, Institut for Kemi, med et Nanodrop 1000. Med SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ følger dataene den teoretiske BSA-koncentration uden yderligere databehandling, både for 0.5 µL- og 3 mL-målinger (Fig.1 A og B). Ved proteinkoncentrationsmåling med et NanoDrop 1000 og dets indbyggede BSA-ekstinktionskoefficient er koncentrationerne imidlertid betydeligt lavere med en faktor på næsten 1.5 for både mikrovolumen- og 3mL-koncentrationsmålinger sammenlignet med de teoretiske koncentrationer. Dette er et almindeligt og kendt problem for de ældre Nanodrop-modeller. Dataene er dog blevet behandlet ved at lave en standardkurve og beregne en korrektionsfaktor på 1.4 (data ikke vist) ved hjælp af standardafvigelsen, hvilket giver mere troværdige resultater sammenlignet med den teoretiske koncentration. Den manglende nøjagtighed og præcision hos de ældre Nanodrop-modeller er tydelig, når målefejlen sammenlignes med de velkalibrerede vægtmålinger. Fejlen svinger mellem 20-40% for målingerne udført med den indbyggede BSA-ekstinktionskoefficient på Nanodrop 1000, og fejlen for de behandlede data ligger mellem 2-20% (Fig.1 C og D). Koncentrationsmålinger med SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ giver derimod en fejl på under 5% for 3mL-målinger og under 8% for mikrovolumen-koncentrationsmålinger i forhold til den teoretiske koncentration (Fig.1 C og D). Bemærkelsesværdigt forbliver fejlen for 0.5 µL-målinger forholdsvis stabil. Fejlen for både 3 mL- og 0.5µL-koncentrationsmålinger ligger konsekvent under Nanodrop 1000-målingerne. Desuden er reproducerbarheden af målingerne udført med smart kuvette og online-software i overensstemmelse med Nanodrop ved højere koncentration (Fig.1 E og F). Hermed demonstrerer vi en direkte proteinkoncentrationsmåling sammen med automatisk online-databehandling og cloud-baseret software til datalagring, med lav og pålidelig fejl i forhold til den teoretiske koncentration og med høj reproducerbarhed. 

A.                                                                                    B.       

C.                                                                                     D.

E.                                                                                     F.

Figur 1: A. Mikrovolumenkoncentration målt med SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ sammen med spektrofotometer og Nanodrop 1000. B. 3 mL-koncentration målt med SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ sammen med spektrofotometer og Nanodrop 1000. C. Fejlprocent plottet for mikrovolumen-koncentrationsmåling. D. Fejlprocent plottet for 3 mL-koncentrationsmåling. E. Reproducerbarhedsrate plottet for mikrovolumen-system. F. Reproducerbarhedsrate plottet for 3 mL-system.

Konklusion

Vi har med succes opnået fremragende følsomhed og dynamisk område for SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ til proteinkvantificering. Det kuvettebaserede UV-Vis-spektrofotometer opnår sin overlegne funktionalitet ved brug af optisk filter i kuvetten og den første onlinebaserede software. Det optiske filter indsat i kuvetten opgraderer den analytiske kapacitet og tilbyder state-of-the-art-ydelse med UV-Vis-spektrofotometeret. Den overlegne ydelse af SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ vurderes ved at sammenligne resultaterne af proteinkvantificering udført med Nanodrop 1000. Kuvette med indsat optisk filter og software sammen med spektrofotometeret gav meget konsistente resultater mellem gentagne målinger med en fejl på under 5% og en reproducerbarhedsrate på over 93% i både mikrovolumen- og 3 mL-proteinkoncentrationsmålinger. Desuden er resultaterne opnået med begge instrumenter sammenlignelige. Mærkningsfri analytmåling, cloud-baseret software, fremragende følsomhed, overlegen ydelse, omkostningseffektivitet, brugervenlighed med fleksibel on-site-drift og sikker datalagringspakke gør SpectroCuvette™ One og SpectroWorks™ til et ideelt forbrugsmateriale til nutidens life science-laboratorium.

Referencer

1. Hu, S., Loo, J. A. & Wong, D. T. Human body fluid proteome analysis. Proteomics 6, 6326–6353 (2006).
2. Gebretsadik, G. & Menon, M. K. C. Proteomics and its applications in diagnosis of auto immune diseases. Open J Immunol 06, 14–33 (2016).
3. Sørensen, K. T., & Kristensen, A. Micromachines, 8(11), [329] (2017).
4. Hermannsson, P. G., Sørensen, K. T., Vannahme, C., Smith, C., Klein, J. J., Russew, M-M., … Kristensen, A.Optics Express, 23(13), 16529-16539. (2015)
5. David B. Hand; The Refractivity of Protein Solutions; The Journal of Biological Chemistry 108, no. 3 (1935)
6. Hermannsson, P. G., Vannahme, C., Smith, C., Sørensen, K. T., & Kristensen, A. Applied Physics Letters, 107(6), [061101] (2015)
7. G. Hermannsson, C. Vannahme, C. L. C. Smith, & A. Kristensen. Appl. Phys. Lett. 105, 071103 (2014).
8. G. Hermannsson, C. Vannahme, C. L. C. Smith & A. Kristensen. Sensors IEEE, (2014).
9. Zhao, H., Brown,P.H, Schuck,P. On the Distribution of Protein Refractive Index Increments. Biophysical Journal 100, 2309-2317 (2011)
10. Khago D, Bierma JC, Roskamp KW, Kozlyuk N, Martin RW. Protein refractive index increment is determined by conformation as well as composition. J Phys Condens Matter. doi: 10.1088/1361-648X/aae000. (2018)
11. http://www.ampolymer.com/dn-dc.html